Impressão 3D por fused deposition modeling (FDM) aplicada à regeneração de cartilagem

Por: André Luiz Almeida Pizzolatti, Fernando Machuca Neto, Jean Nunes, Ari Digiacomo Ocampo Moré, Carlos Rodrigo de Mello Roesler, Gean Vitor Salmoria. Polímeros têm tido grande destaque (como biomateriais) devido à sua flexibilidade de processamento, propriedades mecânicas, biocompatibilidade e bioabsorção. INTRODUÇÃO A engenharia de tecidos, ou engenharia tecidual, é uma área multidisciplinar que engloba princípios das engenharias e ciências da saúde para o desenvolvimento de substitutos biológicos que restauram, mantêm ou melhoram funções de tecidos biológicos. De fundamental importância nesta área são os processos de manufatura viáveis para a obtenção de produtos médicos seguros e eficazes. A prototipagem rápida (PR) ou manufatura aditiva consiste em técnicas que utilizam o processo de adição de material camada a camada a partir de um modelo geométrico computacional. Esse conceito foi desenvolvido no final da década de 80 com o surgimento da técnica de Estereolitografia (SLA). Após um período de dez anos, diversas técnicas surgiram inspiradas em SLA como Sinterização Seletiva a Laser (SLS), Laminate Object Mnufacturing (LOM), Shape Deposition Modeling (SDM) e Fusion Deposition Modeling (FDM). A particularidade no método de construção de cada técnica está, pr incipalmente, no estado físico do material. No método SLA, a manufatura ocorre por meio da fotopolimerização de uma resina líquida por radiação UV, enquanto em SLS, a geometria é obtida a partir da sinterização a laser em camadas do material em pó (Yeong et al., 2004). No método LOM, rolos laminados de material são depositados e ligados uns aos outros, posteriormente sendo recortados via laser. Já o FDM é um método relativamente simples em que o polímero, na forma de filamento ou pellets, é parcialmente fundido e sequentemente extrudado para se realizar a deposição em camadas. O advento destas tecnologias acelerou e tornou menos oneroso o processo de concepção de produtos para o mercado devido à possibilidade da construção de protótipos funcionais em cada estágio de desenvolvimento do produto (Dutta et al., 2001). Atualmente, a PR ultrapassou o campo industrial ocupando lugar de destaque na medicina regenerativa, sendo frequentemente aplicada à engenharia de tecidos. Técnicas de PR vêm sendo utilizadas para a produção de arcabouços (em inglês scaffolds) visando a reconstrução de tecidos (Lethbridge-Cejku et al., 2003). Scaffolds funcionam provendo suporte inicial às células para promover a formação de tecido, além de definir o formato final do tecido cultivado. Esta técnica tem sido aplicada como tratamento alternativo para restauração, principalmente, de tecidos danificados ou com má formação, que apresentam capacidade regenerativa limitada. A cartilagem articular é um tecido que se enquadra neste grupo, tendo em vista a ausência de infiltrado vascular e resultante capacidade regenerativa limitada, em que, na presença de lesões, pode haver progressão do quadro para degeneração com severa limitação da função articular do paciente (Roughley, 2006). Estabelecido este estágio, o tratamento comumente aplicado é a substituição da superfície articular por uma articulação artificial protética via artroplastia total. O presente trabalho apresenta os conceitos, vantagens e desvantagens do emprego da técnica de impressão 3D via Fused Deposition Modeling (FDM), com ênfase na regeneração de cartilagem articular (hialina) através da produção e aplicação de scaffolds poliméricos. Isto permite a obtenção de estruturas anisotrópicas, teoricamente possibilitando ao projetista escolher precisamente algumas propriedades mecânicas e químicas interessantes à sua aplicação. 2. MÉTODO DE FABRICAÇÃO: FUSED DEPOSITION MODDELING A impressão 3D por Fused Deposition Modeling consiste em um método de fabricação por deposição de camadas a partir de polímero em filamento ou pellets. O processo de fabricação pode ser dividido em quatro etapas: a obtenção da geometria em software, ajuste de parâmetros do processo, manufatura propriamente dita e tratamento pós-fabricação (Figura 1). A obtenção da geometria da peça é normalmente realizada em CAD (Computer-Aided Design), com os arquivos posteriormente convertidos para Standard Tesselation Language (STL). Este formato define a geometria da peça através da divisão em malha triangular, permitindo o fatiamento em camadas. Esta etapa é de extrema importância para atingir a precisão desejada, visto que pode levar a diversos erros relacionados à geometria da peça como sobreposição de camadas de material ou falta de malha triangular. O ajuste dos parâmetros do processo visa acertar valores/intervalos como caminho da ferramenta, temperatura do cabeçote, temperatura da câmara de trabalho, espessura da camada depositada e velocidade de deposição do filamento. Estas variáveis determinam a interação entre o processo e as propriedades reológicas e físicoquímicas do material. A temperatura do cabeçote é controlada por meio de resistências elétricas considerando as propriedades do material polimérico (principalmente a Tm). O objetivo é fundir parcialmente o polímero para que este escoe sem sofrer degradação ao ser tracionado para dentro do cabeçote. A medida que é extrudado pelo orifício do cabeçote para a câmara de trabalho, o material sofre choque térmico solidificando-se novamente, uma vez que a temperatura da câmara é menor do que a temperatura de cristalização (Tc) do polímero. A temperatura da câmara também é um parâmetro importante em relação ao comportamento térmico do material, sendo que altas temperaturas impossibilitam uma taxa de solidificação apropriada e baixas temperaturas podem causar distorções no material devido às tensões térmicas. Estas surgem com a solidificação antecipada da camada anterior, na qual a solidificação e contração da camada depositada (posterior) geram tensões térmicas nesta interface. O acúmulo destas tensões camada a camada resulta em distorções no produto final (Casagrande, 2013). A espessura da camada de material é outra variável importante diretamente relacionada à precisão e acabamento obtidos pela técnica, ocasionando perda de detalhes geométricos da peça caso esta não seja adequada. Todavia, uma série de variáveis de processamento influenciam o tamanho da camada depositada. Para que esta seja constante e precisa, deve-se observar a temperatura do bico, a vazão de material, o diâmetro do bico pelo qual o material é extrudado, bem como a velocidade do cabeçote. Estas variáveis estão relacionadas às propriedades reológicas do material. Um exemplo é o controle da velocidade do cabeçote em relação a viscosidade do material à determinada temperatura. Dois materiais com viscosidades diferentes, se extrudados a uma mesma temperatura, podem apresentar camadas com espessura diferente ou variável (Casagrande, 2013). Uma vez que o cabeçote se movimenta no eixo X e Y, ao realizar-se a mudança de direção, por exemplo, na fabricação de uma camada curva de 90°, o cabeçote deve sofrer uma aceleração e desaceleração, podendo atingir velocidades da ordem de 3000 mm/s (www.reprap.org retirado de Casagrande, 2013). Neste instante em que a velocidade não é constante, a vazão também deve ser controlada para que um excesso de material não seja depositado. Logo, os mecanismos de controle de velocidade devem ser precisos para que o tamanho da camada seja constante. Para atingir a aceleração ideal existem dois mecanismos lineares de movimentos ortogonais de controle: por motor de passo e correia, e por servo-motores e fuso. A presença de folga no sistema resulta em perda da precisão (Casagrande, 2013). A geometria do bico de extrusão é outra variável determinante na forma e tamanho do filamento extrudado, sendo que o formato do filamento não é necessariamente o mesmo do bico de extrusão. Devido a efeitos de viscoelasticidade, o material expande ao ser extrudado (Casagrande, 2013). Terminada uma camada, a plataforma de construção é rebaixada no eixo Z para a deposição da nova camada. O deslocamento da plataforma no eixo Z deve ser precisamente do tamanho da camada a ser depositada. Para a fabricação da peça, dependendo da geometria, faz-se necessária a presença de material suporte. O material suporte é responsável por fixar a peça à plataforma e permitir a fabricação de partes desconexas. O material suporte pode ser de material diferente do material da peça ou não. No caso de materiais diferentes, pode-se separar os dois materiais através da solubilização do material suporte e remoção através de banho ultrassônico. Em contrapartida, se os materiais forem iguais, os filamentos extrudados devem ser diferentes em geometria ou processamento, possibilitando a remoção mecânica do suporte devido à diferença de energia entre as camadas. Pode-se citar como vantagem da fabricação via FDM a simplicidade da técnica, a automatização do processo, a reprodutibilidade e a capacidade de produzir peças anisotrópicas. As limitações são o acabamento superficial, a acurácia dimensional e o tempo relativo de fabricação. Atualmente, dentre as diversas técnicas de fabricação de scaffolds via deposição de camadas, o método Fused Deposition Modeling é o mais simples, permitindo a construção de uma estrutura porosa completamente interconectada através de canais com tamanho definido, organizada e reprodutível, utilizando um processo completamente automatizado. A simplicidade do método reside na não utilização de solventes ou processos q u í m i c o s m a i s e l a b o r a d o s , apenas extrusão, favorecendo assim a biocompatibilidade dos produtos e facilitando o manuseio e processamento dos materiais (Zein et al., 2002). Outra característica do método é a possibilidade de se empregar polímeros termoplásticos. Polímeros têm tido grande destaque devido a sua flexibilidade de processamento, propriedades mecânicas, biocompatibilidade e bioabsorção. Pode-se citar os poli (alfa-hidroxi ácido), como poli (ácido láctico) PLA (Korpela et al., 2013) e o poli (ácido glicólico) PGA, e poliésterer, como a policaprolactona PCL. Copolímeros de PLA/ PCL, bem como as blendas de PCL e tricálcio fosfato (TCP) (Holzapfel et al. 2013), e PCL e hidroxiapatita (HA) também têm sido utilizados. FDM APLICADA À PRODUÇÃO DE SCAFFOLDS PARA REGENERAÇÃO DE CARTILAGEM A função do scaffold no processo de regeneração de cartilagem é a substituição temporária da matriz extracelular (MEC) nativa, visando promover um ambiente que permita a fixação, proliferação, e diferenciação das células cultivadas em condrócitos maduros produtores de MEC cartilaginosa (Wiria et al., 2007). Este processo implica no atendimento de critérios de projeto do scaffold, tais como: A) O scaffold deve preencher completamente o sitio de lesão. A existência de espaço entre o tecido hospedeiro e o scaffold pode induzir a formação de tecido fibrocartilaginoso nestes locais. B) Apresentar alta porosidade (acima de 50%) interconectada a fim de permitir a criação de um ambiente tridimensional para a entrada de nutrientes, saída de produtos do metabolismo celular e penetração de células no interior do scaffold. C) Possuir poros da ordem de 400μm (Lohfeld S. et al., 2010) e geometria adequada à fixação celular, pois o aumento da área superficial promove maior interação entre material e células (Holzapfel et al., 2013). Sendo assim o diâmetro do filamento extrudado deve ser o menor possível. D) Apresentar resistência mecânica e rigidez semelhantes à cartilagem, permitindo a imposição de tensões à célula, estimulando assim a síntese de MEC, também evitando sobrecarga às células, o que pode levar à sua degeneração (Woodfield et al., 2004). E) Composto de material biocompatível e bioreabsorvível (tanto o material, quanto seus produtos de degradação) para que estes não estimulem uma resposta inflamatória capaz de promover a morte celular. Além disto, o material deve apresentar comportamento hidrofílico facilitando a adesão celular. F) A taxa de degradação e absorção do material deve ser semelhante à taxa de regeneração do tecido cartilaginoso cultivado, fornecendo espaço e tempo de regeneração adequado ao tecido, caso contrário pode provocar reações adversas no tecido cultivado (Zein et al., 2002; Hutmacher, 2000). Os primeiros scaffolds produzidos por FDM visando a regeneração de tecido cartilaginoso foram realizados por Hutmacher e Col. (2000). Os autores utilizaram PCL em pellets fundidos a 190°C e extrudados a 140°C através de um perfil com diâmetro de 1,63mm. O filamento extrudado era resfriado em água 40mm após a saída do bico obtendo-se filamento com diâmetro 1,70mm ± 0,1mm. Esse filamento foi utilizado para construir blocos com 32mm x 25,5mm x 13,5mm (L x W x H) e uma porosidade de 61%. O padrão de direção do filamento foi de 0/60/120° e 0/72/144/36/108° para desenhar poros com forma triangular e poligonal (Figura 2). A espessura da camada foi de 0,254mm. A temperatura de fusão do bico foi de 120°C e a temperatura da câmara de 25°C. Esse processamento de fabricação do filamento e fabricação da malha não alterou significativamente as propriedades da PCL. A fração de cristalinidade foi de 55,9%, 58% e 57,3%, respectivamente com índices de polidispersão de 1,7815, 1,7187 e 1,68. Os scaffolds 0/60/120° apresentaram propriedades mecânicas superiores à estrutura com 0/72/144/36/108°. O módulo compressivo médio do primeiro foi de 29,4 ± 4 MPa e tensão de escoamento de 2,3 ± 0,2 MPa. Já os scaffolds 0/72/144/36/108° apresentaram módulo compressivo médio de 21,5 ± 2,9 MPa e tensão de escoamento de 2,0 ± 0,2 MPa. Ambos os tipos demonstraram biocompatibilidade. Os fibroblastos e osteoblastos em cultura apresentaram boa adesão e proliferação, com baixa apoptose celular verificada após 3 semanas de cultivo. Esse resultado demonstrou que o scaffold é biocompatível, todavia não foram utilizados condrócitos para a obtenção de cartilagem. Scaffolds monofásicos, no entanto, não mimetizam o ambiente natural em lesões osteocondrais (Swieszkowski et al., 2007). Neste caso, existe a necessidade de um scaffold que possua organização estrutural e propriedades mecânicas de cartilagem e tecido ósseo. Por este motivo, tem-se utilizado scaffolds com dois tipos de materiais ou com camadas distintas. Kalita e Col. (2003) sintetizaram scaffolds por FDM a partir de filamentos de polipropileno (PP) e tricálcio fosfato (TCP) a 20,5 vol. % objetivando avaliar o efeito de diferentes materiais, porosidades, e geometrias de poro sob a adesão e proliferação celular (Figura 3). O PP é um material biocompatível, porém não é bioabsorvível. Dessa forma, o scaffold permanece no organismo não dando lugar à MEC a ser produzida. Ainda que o material não seja o indicado, o estudo trouxe contribuições a respeito da porosidade. O percentual de porosidade variou entre 36% a 52%. O tamanho de poro obtido variou entre 150-200μm. Os resultados demonstraram que scaffolds com TCP apresentaram maior proliferação celular do que apenas PP. A proliferação celular em 14 dias de cultura foi maior em scaffolds com maior percentual de porosidade, apesar de a taxa de crescimento celular diminuir entre os dias 14 e 21. Por outro lado, em scaffolds mais densos, houve uma diminuição no número de células a partir do 14º dia. Desta forma, demonstrou-se que, além do tipo de energia e polaridade do material, o percentual de porosidade, a interconectividade e o tamanho dos poros são fatores relevantes para a proliferação celular. Comprovou-se, também, a capacidade da FDM em sintetizar scaffolds compósitos de polímeros e cerâmica. Um conceito de scaffold bifásico para defeito osteocondral foi realizado por Swieszkowski et al., (2007). No estudo foram fabricados scaffolds de PCL e TCP para o tecido ósseo e PCL para o tecido cartilaginoso por FDM. Outro scaffold foi fabricado com PCL e TCP para tecido ósseo e fibrina para o tecido cartilaginoso. Os scaffolds PCL/ TCP-PCL apresentaram melhor desempenho na síntese de matriz celular cartilaginosa. A fibrina apresenta rápida degradação e não fornece resistência mecânica suficiente para permitir a proliferação celular. Outra peculiaridade do tecido cartilaginoso articular hialino é a distribuição de matriz extracelular e de células (condrócitos) estratificada, podendo ser dividida em três camadas (Athanasiou et al., 2013), onde sua zona superficial concentra grande quantidade de água e condrócitos dispostos em paralelo à superfície articular. Estes condrócitos sintetizam grande quantidade de fibras de colágeno também dispostas em paralelo à superfície articular para suportar tensões cisalhantes. À medida que aumenta a profundidade, chega-se à zona intermediária, na qual a quantidade de água diminui e de proteoglicanos (PG) aumenta. Os condrócitos localizados nesta porção apresentam formato arredondado e estão mais espaçados. As fibras colágenas presentes estão dispostas em orientação diversa. Na zona mais profunda, os condrócitos estão dispostos em colunas, e as fibras colágenas em sentido perpendicular ancoram-se ao osso subcondral. O osso subcondral por ser rico em vasos, provê a cartilagem com nutrientes, oxigênio e células com poder de diferenciação em condrócitos maduros. Devido, a essa configuração da cartilagem, tem-se pesquisado scaffolds estratificados, a partir da hipótese que estes podem ser capazes de gerar tecidos cartilaginosos também estratificados. Scaffolds em PCL e Hidroxiapatita produzidos com tamanhos de poro de 200μm na porção superficial e de 400μm nas camadas mais profundas foram desenvolvidos por Lee et al., (2010) (Figura 4). Esses scaffolds foram implantados em úmeros de coelhos brancos da Nova Zelândia. Após 4 meses, foi observada a formação de tecido semelhante à cartilagem com colágeno tipo II e glicosaminoglicanos (GAGs). Todavia, não se pôde avaliar se o tecido obtido possuía uma composição estratificada. Apesar da necessidade de uma análise mais criteriosa do tecido obtido, a grande inovação desse estudo foi a produção de um scaffold estratificado que permitiu o autorreparo da cartilagem a partir de células migradas do osso subcondral. A inexistência de vasos sanguíneos no tecido regenerado, possivelmente devido à baixa permeabilidade, também foi um ponto positivo para a formação do tecido cartilaginoso. 3. CONSIDERAÇÕES FINAIS A manufatura de scaffolds via Fused Deposition Modeling se apresenta como uma alternativa interessante na busca de dispositivos que promovam a regeneração da cartilagem fundamentalmente por apresentar relativo baixo custo, simplicidade e reprodutibilidade, e ser capaz de produzir estruturas organizadas e complexas com alta porosidade e completa interconexão entre os poros. Isto permite a obtenção de estruturas anisotrópicas, teoricamente possibilitando ao projetista escolher precisamente algumas propriedades mecânicas e químicas interessantes à sua aplicação. Outro ponto positivo é a capacidade de se empregar diversos biomateriais poliméricos sem a utilização de solventes, o que favorece a biocompatibilidade dos scaffolds produzidos. Em contrapartida, a FDM é limitada na capacidade de produzir scaffolds com filamentos de diâmetro submicrométrico que poderiam criar um ambiente mais favorável à adesão celular. Apesar de demonstrar eficiência na produção de scaffolds que possuam requisitos necessários, o emprego do processo de fabricação de scaffolds via FDM ainda não permitiu a obtenção um tecido com a proporção de tipos de fibras colágenas II, VI, IX, XI, XII, XII e GAGs similar à cartilagem articular nativa, bem como a obtenção de uma estrutura estratificada com diferente distribuição de MEC e células. A consequência disso é a obtenção de um tecido que não possui as mesmas propriedades mecânicas da cartilagem. Outros fatores além do scaffold, como a adição de fatores de crescimento e o carregamento mecânico durante a cultura, possuem influência nas propriedades do tecido obtido e precisam, portanto, ser investigados.

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